高考-法醫師法醫生物學104 年第 21 題單選題
進行PCR所使用之primer，設計時須考量之因子何者較適合？
A長度應為 30～50 bases
BGC 含量應佔 20～30%
Cforward 及 reverse primer 彼此 Tm 值之差異應小於 $10^{\circ}$ C
D最好能少於 4 個相同鹼基的連續出現正確答案
D正確答案
PCR primer 設計四大原則：長度 18-25 bp、GC 40-60%、兩 primer Tm 差小於 5°C、避免 4 個以上連續相同鹼基。
為什麼答案是 D
避免 4 個以上相同鹼基連續出現（如 AAAA、GGGG），可防止 mispriming、slippage 及二級結構，提高專一性。此為正確設計原則。
載入中…
完整詳解
Pro · 無限重點 PCR primer 設計四大原則：長度 18-25 bp、GC 40-60%、兩 primer Tm 差小於 5°C、避免 4 個以上連續相同鹼基。
用刪去法：A 太長、B GC 太低、C 溫差太大，只剩 D。
逐選項分析
A✕ 陷阱
Primer 長度一般為 18～25 bases（最多不超過 30），太長會降低專一性、延長 annealing 時間，且增加二級結構形成機會。30～50 bases 太長。
B✕
GC 含量應為 40～60%，太低會使 Tm 值過低、結合不穩定；太高則易形成二級結構。20～30% 明顯過低。
C✕ 陷阱
Forward 與 reverse primer 的 Tm 差異應 < 5°C（理想 < 2°C），才能在同一 annealing 溫度下有效配對。差 10°C 太大，會造成其中一支 primer 效率不佳。
D✓ 正確
避免 4 個以上相同鹼基連續出現（如 AAAA、GGGG），可防止 mispriming、slippage 及二級結構，提高專一性。此為正確設計原則。
PCR Primer 設計黃金法則
| 項目 | 建議範圍 | 原因 |
|---|
| 長度 | 18～25 bases | 兼顧專一性與效率 |
| GC 含量 | 40～60% | 維持適當 Tm 與穩定性 |
| Tm 值 | 55～65°C | annealing 溫度設計依據 |
| 兩 primer Tm 差 | < 5°C | 同步 annealing |
| 連續相同鹼基 | < 4 個 | 避免 mispriming |
| 3' 端 | 避免 GC-rich | 降低非專一性結合 |
本題四個選項都在講「數字範圍」，考生若沒背熟標準值很容易被誤導。記憶口訣：「長度 20、GC 50、Tm 差 5、連續 4」，對照選項即可快速判斷 A/B/C 的數字都偏離標準。 
