高考-法醫師法醫生物學109 年第 14 題單選題
以 PCR 進行目標 DNA 複製時，關於引子之設計考量，請選出不恰當者：
A引子的長度最好不要大於 30 bases
B兩條引子的距離最好不要大於 500 bp正確答案
C兩條引子的 $T_{m}$ 差異最好不要大於 $5^{\circ}C$
D引子之 GC 含量最好介於 40%～60%之間
B正確答案
PCR引子設計四原則：長度18-30bp、GC含量40-60%、Tm值差≤5℃、產物長度通常100-1000bp皆可，非限500bp內。
為什麼答案是 B
不恰當敘述（本題要選）。兩引子間距離即PCR產物長度，一般可從100bp到數kb皆可擴增，標準Taq聚合酶可擴增至3-5kb，並非限500bp內。
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完整詳解
Pro · 無限重點 PCR引子設計四原則：長度18-30bp、GC含量40-60%、Tm值差≤5℃、產物長度通常100-1000bp皆可，非限500bp內。
B選項「500 bp」是陷阱！PCR產物長度可到數kb，500bp不是硬性上限。其他三項皆為標準設計準則。
逐選項分析
A✕
正確敘述。引子長度標準為18-30 bases，過短會降低專一性，過長則合成成本高且Tm過高。30 bases是常見上限。
B✓ 正確
不恰當敘述（本題要選）。兩引子間距離即PCR產物長度，一般可從100bp到數kb皆可擴增，標準Taq聚合酶可擴增至3-5kb，並非限500bp內。
C✕
正確敘述。兩引子Tm值差異應盡量小（建議≤5℃），否則退火溫度難以設定，會造成其中一條引子結合效率低落。
D✕
正確敘述。GC含量40-60%可確保引子結合穩定性適中，GC過高易形成二級結構，過低則結合力弱。
PCR 引子設計黃金準則
| 項目 | 建議範圍 | 原因 | 違反後果 |
|---|
| 長度 | 18-30 bases | 兼顧專一性與成本 | 太短非專一、太長Tm過高 |
| GC含量 | 40%-60% | 結合穩定度適中 | 過高形成二級結構 |
| Tm差 | ≤ 5°C | 退火溫度好設定 | 一條引子效率差 |
| 產物長度 | 100bp-數kb | 視聚合酶能力 | 過長需用長片段酶 |
B選項把PCR產物長度硬限在500bp是誤導。實務上標準Taq可擴增至3-5kb，長片段PCR甚至可達20kb以上。考生若只記「PCR適合短片段」易誤判B為正確敘述。 
