專技高考-醫事檢驗師醫學分子檢驗學與臨床鏡檢學（包括寄生蟲學）109 年第 73 題單選題
固態腫瘤樣本常同時包含腫瘤部分（tumor part）及相鄰非腫瘤部分 (adjacent non-tumor part）；下列何種分子檢驗方法最容易因為非腫瘤部分的干擾而難以檢測出腫瘤基因突變？
A次世代定序法（Next-generation sequencing, NGS）
BScorpions ARMS（Amplification Refractory Mutation System）法
C數位化聚合酶連鎖反應（digital PCR）
D桑格定序法（Sanger sequencing）正確答案
D正確答案
Sanger 定序法靈敏度最低（需突變比例約 15-20% 以上），最易被非腫瘤細胞稀釋而漏檢。
為什麼答案是 D
Sanger 定序仰賴電泳圖峰高判讀，突變峰需占總訊號 15-20% 以上才可辨識。當腫瘤被大量非腫瘤細胞稀釋時，突變峰會被野生型峰蓋過而漏檢。
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完整詳解
Pro · 無限重點 Sanger 定序法靈敏度最低（需突變比例約 15-20% 以上），最易被非腫瘤細胞稀釋而漏檢。
比四種方法的『最低偵測極限』：Sanger ~20% > NGS ~1-5% > ARMS ~1% > digital PCR ~0.01%。靈敏度最差的就是答案。
逐選項分析
A✕
NGS 因高深度定序（deep sequencing），可達 1-5% 突變偵測極限，搭配 UMI 甚至更低，較不易被正常細胞 DNA 稀釋。
B✕
Scorpions ARMS 利用突變特異性引子，只擴增突變序列，靈敏度可達 1%，常用於 EGFR 突變檢測（如 cobas、therascreen），抗稀釋能力佳。
C✕ 陷阱
digital PCR 將樣本切成數萬個微反應，單分子計數，靈敏度最高可達 0.01%，最不易受非腫瘤組織稀釋影響，是液態切片首選。
D✓ 正確
Sanger 定序仰賴電泳圖峰高判讀，突變峰需占總訊號 15-20% 以上才可辨識。當腫瘤被大量非腫瘤細胞稀釋時，突變峰會被野生型峰蓋過而漏檢。
四大突變檢測方法靈敏度比較
| 方法 | 偵測極限 | 原理 | 抗稀釋能力 |
|---|
| Sanger 定序 | ~15-20% | 雙脫氧終止 + 電泳 | 最差 |
| NGS | ~1-5% | 大量平行深度定序 | 佳 |
| Scorpions ARMS | ~1% | 突變特異性引子 PCR | 佳 |
| digital PCR | ~0.01-0.1% | 單分子分區計數 | 最佳 |
分子檢測方法不是越新越好,而要看「最低檢測閾值」。Sanger 定序雖是經典金標準,但它靠峰高判讀,突變訊號必須佔 15-20% 以上才看得出來,一旦檢體混入過多正常細胞,腫瘤突變就會被稀釋到峰值以下而漏掉。相比之下 NGS 深度定序、突變特異引子、單分子計數都能抓到低於 5% 的突變,因為它們用的是「訊號放大」或「分子計數」邏輯,不依賴峰高比例。臨床上液態切片或異質性高的檢體,最怕用 Sanger 這種「吃不到低頻突變」的方法。
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