專技高考-醫事檢驗師醫學分子檢驗學與臨床鏡檢學（包括寄生蟲學）112 年第 57 題單選題
二維電泳配合蛋白質譜分析的實驗前後順序，下列何者最適當？①特定酵素水解蛋白 ②一維等電點聚焦電泳 ③膠體染色 ④檢體製備 ⑤二維聚丙烯醯胺凝膠電泳
A④②⑤③①正確答案
B④①②⑤③
C④③①②⑤
D①②③⑤④
A正確答案
二維電泳流程：檢體製備→等電點聚焦(一維)→SDS-PAGE(二維)→染色→切膠酵素水解後送質譜分析。
為什麼答案是 A
④檢體製備→②一維等電點聚焦(依等電點分離)→⑤二維SDS-PAGE(依分子量分離)→③膠體染色(顯影蛋白點)→①特定酵素(如trypsin)水解切下的目標蛋白點再送質譜，順序完全正確。
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完整詳解
Pro · 無限重點 二維電泳流程：檢體製備→等電點聚焦(一維)→SDS-PAGE(二維)→染色→切膠酵素水解後送質譜分析。
口訣：先備樣，再分電荷(IEF)，後分大小(SDS-PAGE)，染色看點，最後切點水解送質譜。
逐選項分析
A✓ 正確
④檢體製備→②一維等電點聚焦(依等電點分離)→⑤二維SDS-PAGE(依分子量分離)→③膠體染色(顯影蛋白點)→①特定酵素(如trypsin)水解切下的目標蛋白點再送質譜，順序完全正確。
B✕ 陷阱
把①酵素水解放在電泳前是錯誤的。蛋白質應先以完整型態進行二維分離與染色，鎖定目標蛋白點後才切膠並酵素水解成胜肽片段，才能送質譜定序鑑定。
C✕
③染色與①水解被放到電泳之前，邏輯不通。染色需在蛋白質完成分離後才能顯影，酵素水解更是質譜前最後步驟，本選項完全打亂流程。
D✕
將④檢體製備放在最後、①酵素水解放在最前，完全違反實驗邏輯。檢體製備一定是第一步，此選項明顯不合理。
二維電泳結合質譜分析標準流程
| 步驟 | 操作 | 原理/目的 |
|---|
| 1 | ④檢體製備 | 萃取並溶解蛋白質 |
| 2 | ②一維等電點聚焦(IEF) | 依蛋白質等電點(pI)分離 |
| 3 | ⑤二維SDS-PAGE | 依分子量大小分離 |
| 4 | ③膠體染色 | Coomassie/銀染顯出蛋白點 |
| 5 | ①特定酵素水解 | 切下蛋白點切成胜肽，送質譜 |
最常見陷阱是把『酵素水解(①)』放在電泳前。實際上必須先完成二維分離與染色，鎖定目標蛋白點後才切膠進行酵素水解(in-gel digestion)，產生胜肽片段供質譜定序，順序絕不能顛倒。
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