專技高考-醫事檢驗師醫學分子檢驗學與臨床鏡檢學（包括寄生蟲學）111 年第 49 題單選題
進行次世代定序的主要步驟包括：①PCR增幅 ②定序 ③結果分析 ④文庫建構，下列何種順序最適當？
C正確答案
次世代定序流程：先建文庫(④)→PCR增幅(①)→定序(②)→結果分析(③)，正確順序④①②③，選C。
為什麼答案是 C
④①②③：先建構文庫(④，DNA片段化並接上接頭)，再PCR增幅(①)放大訊號，接著定序(②)讀取鹼基，最後結果分析(③)生物資訊判讀。完全符合NGS標準流程。
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完整詳解
Pro · 無限重點 次世代定序流程：先建文庫(④)→PCR增幅(①)→定序(②)→結果分析(③)，正確順序④①②③，選C。
題目編號：①PCR增幅、②定序、③結果分析、④文庫建構。記憶執行順序：建庫→放大→讀序→分析。結果分析(③)一定在最後，先刪B；定序(②)前必先建庫(④)，刪D；增幅(①)前必先建庫(④)，刪A，剩C。
逐選項分析
A✕ 陷阱
①②④③把PCR增幅(①)放最前面，但增幅前必須先完成文庫建構(④，片段化、接接頭)，否則無模板可增幅，順序顛倒。
B✕
②③④①把定序(②)放第一、結果分析(③)放第二完全顛倒，結果分析必須在定序產生序列資料後才能進行，邏輯不通。
C✓ 正確
④①②③：先建構文庫(④，DNA片段化並接上接頭)，再PCR增幅(①)放大訊號，接著定序(②)讀取鹼基，最後結果分析(③)生物資訊判讀。完全符合NGS標準流程。
D✕ 陷阱
②④①③把定序(②)放最前面，但須先建文庫(④)與增幅(①)才有足夠模板可供定序，定序不可能是第一步。
次世代定序(NGS)標準流程（依執行先後排序）
| 執行順序 | 題目編號 | 中文名稱 | 主要工作 | 目的 |
|---|
| 第1步 | ④ | 文庫建構 | DNA片段化、修補末端、接上接頭(adapter) | 製備可定序的模板 |
| 第2步 | ① | PCR增幅 | 橋式PCR或乳化PCR放大訊號 | 增加每個cluster訊號強度 |
| 第3步 | ② | 定序 | 邊合成邊定序讀取鹼基 | 產生原始序列reads |
| 第4步 | ③ | 結果分析 | 序列比對、變異判讀(bioinformatics) | 解讀生物學意義 |
本題陷阱在於誘導考生把熟悉的『PCR(①)』或『定序(②)』直覺放在最前面。實際上NGS必須先做文庫建構(④)才能增幅與定序，而結果分析(③)恆為最後步驟。注意題目編號順序(①②③④)並非執行順序，正確執行順序為④①②③。
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