專技高考-醫事檢驗師醫學分子檢驗學與臨床鏡檢學(包括寄生蟲學)110 年第 79 題單選題
關於桑格定序法(Sanger sequencing)分析的敘述,下列何者錯誤?
AG、A、T、C的訊號高度不適合作為核苷酸相對比例的標準
B檢測的變異位點愈靠近sequencing primer愈好正確答案
C應進行雙向(bidirectional)序列分析
D應先訂定訊號強度(peak intensity)、基線波動(baseline fluctuation)、訊號與雜訊比例(signal-to-noise ratio)等判讀標準
B正確答案
桑格定序的變異位點不應太靠近primer,因為primer附近約前20-50個鹼基訊號品質差、不可靠,B為錯誤敘述。
為什麼答案是 B
錯誤敘述(即本題答案)。緊鄰sequencing primer的前約20-50個鹼基訊號品質差、波峰雜亂不穩定,變異位點若太靠近primer反而不易準確判讀,應落在序列中段訊號穩定區。
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完整詳解
Pro · 無限重點 桑格定序的變異位點不應太靠近primer,因為primer附近約前20-50個鹼基訊號品質差、不可靠,B為錯誤敘述。
記住「primer旁邊不準」:序列開頭數十個鹼基訊號雜亂,變異點應落在訊號穩定的中段才好判讀。
逐選項分析
A✕
正確敘述。四種鹼基的螢光標記與摻入效率不同,導致peak高度本身差異大,不能直接拿訊號高度當作核苷酸相對比例的定量標準,需謹慎判讀。
B✓ 正確
錯誤敘述(即本題答案)。緊鄰sequencing primer的前約20-50個鹼基訊號品質差、波峰雜亂不穩定,變異位點若太靠近primer反而不易準確判讀,應落在序列中段訊號穩定區。
C✕
正確敘述。為提高判讀可信度並相互驗證,應同時進行正向與反向(雙向)定序,雙股結果一致才能確認變異真實存在,避免單一方向假象。
D✕
正確敘述。判讀前應先建立訊號強度、基線波動、訊號雜訊比等品質判讀標準(QC criteria),確保結果可靠且具一致性,符合實驗室品保原則。
桑格定序判讀品質要點
| 項目 | 正確做法 | 原因 |
|---|
| 變異位點位置 | 落在序列中段 | primer旁前數十鹼基訊號差 |
| 定序方向 | 雙向(正反兩股) | 相互驗證避免假象 |
| peak高度 | 不作定量比例標準 | 螢光與摻入效率不一 |
| 判讀標準 | 先訂QC criteria | 確保一致與可靠 |
題目把「變異位點愈靠近primer愈好」當作正確敘述設陷阱。事實相反:primer附近前約20-50鹼基訊號雜亂不可靠,變異點應避開primer區、落在訊號穩定的中段,才能準確判讀。
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